Universidad Nacional Abierta y a Distancia

Vicerrectoría Académica y de Investigación

Curso: Cromatografía
Código: 401542

Anexo 3 - Guía para el desarrollo Tarea 4 – Técnicas

cromatográficas específicas.

Nombre del estudiante: Laura Ximena Montes Estrada

Código: 1088020290 Programa: Ingeniería de Alimentos

Ejercicio 1 – Descripción de las técnicas cromatográficas:

Cromatografía Iónica y de Fluidos Supercríticos.
Tabla 1. Ejercicio 1
Link grabación. https://youtu.be/YR8Pw6o0qrY

Ejercicio 2. Parámetros para el análisis e interpretación de datos de

Cromatografía Iónica y de Fluidos Supercríticos.

Tabla 2. Ejercicio 2A
Ítem escogido Ítem C: Análisis del efecto de las cargas sobre la
retención de compuestos.
Intercambiadores En el contexto de los intercambiadores
aniónicos aniónicos, estos son una clase de resinas
utilizadas en cromatografía de intercambio
iónico que están diseñados para separar y
purificar moléculas basándose en la carga
eléctrica de los grupos funcionales presentes en
las moléculas. Estas resinas contienen grupos
funcionales cargados positivamente, como los
grupos amino alifáticos o aromáticos, que son
capaces de atraer y retener moléculas con
carga negativa.

Además, los ácidos succinato y malato también

pueden interactuar con los intercambiadores
aniónicos debido a sus grupos funcionales
cargados negativamente. Al igual que con otros
compuestos cargados negativamente, estos
ácidos pueden unirse a los sitios de unión de la
resina y competir con otros compuestos por la
retención en la resina.

En general, los intercambiadores aniónicos son

 útiles para la separación y purificación de
compuestos con cargas eléctricas negativas y
se utilizan en una variedad de aplicaciones,
incluyendo la separación de proteínas y ácidos
nucleicos. La retención y separación de estos
compuestos se ve afectada por la interacción
entre las cargas eléctricas de los grupos
funcionales presentes en la molécula y la carga
eléctrica de los grupos funcionales presentes en
la resina.
Intercambiadores los intercambiadores catiónicos pueden
catiónicos interactuar con compuestos inorgánicos como
iones de sodio o potasio, o con cationes
orgánicos como el cloruro de tetraetilamonio,
para afectar la retención de los compuestos.
Además, los intercambiadores catiónicos
también pueden retener compuestos orgánicos
cargados positivamente, como proteínas o
péptidos que contienen grupos funcionales
cargados positivamente, como la lisina o la
arginina.
Los intercambiadores catiónicos son útiles para
la separación y purificación de compuestos con
cargas eléctricas positivas y se utilizan en una
variedad de aplicaciones, incluyendo la
separación de proteínas y péptidos cargados
positivamente. La retención y separación de
estos compuestos se ve afectada por la
interacción entre las cargas eléctricas de los
grupos funcionales presentes en la molécula y
la carga eléctrica de los grupos funcionales
presentes en la resina.
Fase de equilibrio. Se comprende como la primera etapa de la fase
estacionaria. La cual tiene las condiciones de
inicio del proceso. Al iniciar y llegar a equilibrio,
esta se asocia a iones de cloro o Sodio.
En la fase de equilibrio, después de que los
compuestos se han unido a la matriz de
separación, el equilibrio entre las fuerzas
electrostáticas que unen los compuestos a la
matriz y las fuerzas que los liberan se ha
establecido. En este punto, la cantidad de
compuestos retenidos se mantiene constante y
se ha alcanzado la máxima capacidad de
retención.

El análisis del efecto de las cargas en la fase de

equilibrio es importante para la optimización de
los procesos de separación, ya que permite
seleccionar las condiciones adecuadas para la
separación de los compuestos de interés.
Además, el conocimiento de la capacidad de
retención de los compuestos en una matriz de
separación específica permite predecir la
 cantidad de compuestos que se retendrán y el
tiempo necesario para la separación completa.
Fase de aplicación Los de los compuestos y de la matriz de
y lavado separación en la capacidad de retener y liberar
los compuestos durante estas etapas.

Durante la fase de aplicación, los compuestos

se aplican a la columna de separación y se unen
a la matriz de separación mediante
interacciones electrostáticas entre las cargas
eléctricas de los compuestos y de los grupos
funcionales de la matriz. La cantidad de
compuestos que se unen a la matriz durante
esta etapa depende de factores como la
concentración de los compuestos, la fuerza de
las cargas y la densidad de los grupos
funcionales.

Durante la fase de lavado, se utiliza una

solución de lavado para eliminar los compuestos
no retenidos y los compuestos que se han unido
débilmente a la matriz. La efectividad del
lavado depende de la fuerza de las
interacciones electrostáticas entre los
compuestos y la matriz, así como de la
composición de la solución de lavado. Por
ejemplo, se pueden utilizar soluciones con
mayor concentración de iones o pH diferente
para alterar las interacciones electrostáticas y
mejorar la eficiencia del lavado.
Fase elusión Durante la fase de aplicación y lavado. La
elución se logra al utilizar una solución eluyente
que desplaza los compuestos retenidos en la
matriz y los lleva fuera de la columna de
separación.

El análisis del efecto de las cargas sobre la

retención de compuestos durante la fase de
elución se enfoca en la influencia de las cargas
eléctricas de los compuestos y de la matriz de
separación en la velocidad y eficacia de la
elución.

La eficacia de la elución depende de la fuerza

de las interacciones electrostáticas entre los
compuestos y la matriz, así como de la
composición de la solución eluyente. Por
ejemplo, se pueden utilizar soluciones eluyentes
con mayor concentración de iones o pH
diferente para alterar las interacciones
electrostáticas y mejorar la eficiencia de la
elución.
Fase Regeneración la fase de regeneración se refiere al proceso de
restaurar la matriz de separación a su estado
 original después de la fase de elución. Durante
la fase de elución, los compuestos se separan y
se eliminan de la matriz, pero a menudo
quedan residuos en la columna que pueden
afectar la capacidad de la matriz para retener y
separar los compuestos en futuras aplicaciones.

La regeneración se logra al utilizar una solución

de regeneración que elimina los residuos y
restablece la matriz de separación. El análisis
del efecto de las cargas sobre la retención de
compuestos durante la fase de regeneración se
enfoca en la influencia de las cargas eléctricas
de los compuestos y de la matriz de separación
en la eficacia de la regeneración.

La eficacia de la regeneración depende de la

fuerza de las interacciones electrostáticas entre
los residuos y la matriz de separación, así como
de la composición de la solución de
regeneración. Por ejemplo, se pueden utilizar
soluciones de regeneración con mayor
concentración de iones o pH diferente para
alterar las interacciones electrostáticas y
mejorar la eficiencia de la regeneración.
Tipo de columna Se uso una o dos columnas de separación 6mm
*150mm. Rellenas d resina de intercambio
catiónico débil a base de polimetracrilato h+-.
Con tamaño de partícula 3 micrómetros y
capacidad de intercambio catiónico de 0,1
meq/ml.
Al poner en funcionamiento dos columnas, el
tiempo de retención aumento.
Longitud de Columna de separación, una o dos Tosoh TSJgel
columna Super IC a/C (6mm DI X 150 mm)
Tipo de resinas La resina utilizada en el análisis es una
polimerización de metacrilato ácido débil, que
se encuentra en forma H+. Esto significa que
los grupos funcionales en la resina son ácidos
débiles, que pueden perder un protón y
convertirse en aniones, lo que es importante
para la capacidad de intercambio catiónico de la
resina. La resina tiene un tamaño de partícula
de 3 micras y una capacidad de intercambio
catiónico de 0,1 meq/ml, lo que significa que
puede unir una cantidad limitada de iones
cargados en solución.

La elección de una resina de intercambio

catiónico es crucial para la separación y análisis
de los iones cargados en la muestra, ya que los
grupos funcionales de la resina atraen
selectivamente a los iones de carga opuesta en
la solución. En este caso, la resina tiene una
 capacidad de intercambio catiónico, lo que
significa que atrae a los iones cargados
positivamente en la muestra. La resina también
es ácida, lo que significa que los iones cargados
positivamente en la solución pueden ser
retenidos en la resina a través de la interacción
con los grupos ácidos débiles.

El tamaño de partícula de la resina es

importante porque afecta la velocidad y la
eficiencia de la separación. Una resina con
partículas más grandes puede retener
selectivamente iones cargados, pero puede
tardar más en separarlos y reducir la eficiencia
de la separación. Una resina con partículas más
pequeñas puede ser más eficiente en la
separación, pero también puede tener una
mayor presión en la columna y afectar el flujo
de la solución.

En resumen, la elección de la resina de

intercambio catiónico adecuada es importante
para la separación y análisis de iones cargados
en solución, y factores como el tamaño de
partícula y la capacidad de intercambio
catiónico deben tenerse en cuenta al elegir una
resina para la separación y análisis.
Tiempos de Al cambiar de una sola columna a dos
retención columnas, se observó un aumento significativo
en el tiempo de retención de las sustancias
analizadas. Esto puede deberse a varios
factores, como la mayor longitud total de la
columna y la mayor superficie de la fase
estacionaria, lo que aumenta la interacción
entre las moléculas y la fase estacionaria.
Además, al usar dos columnas, se requiere más
tiempo para que la muestra se mueva a través
de ambas columnas.

Se observó que los tiempos de retención de las

sustancias analizadas varían significativamente,
lo que sugiere que la interacción de las
moléculas con la fase estacionaria también
varía en función de las propiedades químicas de
cada sustancia. En particular, se encontró que
el grado de retención del etanol depende de la
interacción hidrofóbica en la fase de resina, lo
que sugiere que la polaridad de la sustancia es
un factor importante en la retención.

El uso de una mayor cantidad de eluyente ácido

puede reducir el tiempo de análisis, pero
también puede afectar la selectividad de la
cromatografía. En este caso, la medida de
 eluyente fue de 2 mM de ácido ftálico más 18
corona 6,1 mM y molibdato de potasio 10 mM,
así como ácido sulfúrico 50 mM. Es importante
encontrar un equilibrio entre el tiempo de
análisis y la selectividad de la cromatografía,
para obtener los resultados más precisos y
útiles.
Gradientes Al aumentar la concentración en la fase móvil,
los iones son mas atraídos el eluyente con la
muestra por la fase estacionaria.
“Cuando se aumenta la concentración de la fase
móvil, los iones compiten cada vez más
favorablemente con la muestra por los sitios
activos cargados de la fase estacionaria (Strack,
s.f)
Ítem C: Análisis del En este proceso, la fase estacionaria es un
efecto de las material con cargas opuestas a las de las
cargas sobre la moléculas a separar, y la fase móvil es un
retención de eluyente que compite con las moléculas a
compuestos. separar por las cargas del material de la fase
estacionaria.

En la evaluación de la calidad de la
fermentación en la cerveza, se pueden evaluar
diversas moléculas, incluyendo iones de cloruro
o sulfato, iones de sodio o potasio, niveles de
alcohol, y cantidades de citrato o piruvato. Los
aniones orgánicos como citrato y piruvato, así
como los cationes de sodio y potasio, son
importantes para evaluar el nivel de
fermentación de la cerveza. Por lo tanto, se
requiere una fase estacionaria con capacidad de
intercambio catiónico para retener y separar
estas moléculas.

En este caso, se utilizó una fase estacionaria

basada en ácido-base polimetacrilato, que tiene
capacidad de intercambio catiónico. Esta fase
estacionaria retiene ligeramente el citrato y
piruvato, pero da movilidad al succinato y
malate. La interacción de estos compuestos con
el solvente ftálico + 18 corona + molibdato de
potasio permite arrastrarlos con un porcentaje
de retención aceptable para hacer el
cromatograma y visualizar las moléculas. Esto
permite evaluar el nivel de fermentación de
cada muestra de cerveza y determinar su
calidad.
Referentes de Kozaki, D., Tanihata, S., Yamamoto, A.,
información Nakatani, N., Mori, M., & Tanaka, K. (2019).
(norma APA 7.0) Single injection ion-exclusion/cation-exchange
chromatography for simultaneous determination
of organic/inorganic anions, inorganic cations,
and etanol in Beer samples. Food Chemistry,
274, 679-685.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.09.02
7
*Index of /Docencia-Virtual/BQblog. (s. f.).
http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/
 Tabla 2. Ejercicio 2B
Analizar las condiciones en que se realizaron los ensayos
cromatográficos supercríticos.
En cuanto a la cromatografía supercrítica, se utilizaron diferentes
condiciones de presión y temperatura para la eliminación de lípidos
no polares. Se emplearon presiones de 35, 41.4 y 55 Mpa y
temperaturas de 40 y 60°C para lograr esta separación. Además, se
realizaron extracciones con etanol al 10, 15 y 20% para extraer los
polares.

Se observó que la extracción con CO2 dejó algunos no polares en el

residuo, pero el uso de etanol al 20% como solvente polar permitió
arrastrar los residuos no polares restantes. Se evaluó la eficacia de
la extracción utilizando diferentes métodos y se determinó que la
extracción por fluidos supercríticos, en combinación con la
extracción con etanol al 20%, fue la mejor opción para obtener los
fosfolípidos lácteos deseados como ingredientes funcionales.

Además, se realizaron otros procedimientos para la eliminación de

lípidos no polares, como la extracción líquido-líquido con cloroformo
y metanol, y el análisis de proteínas con Leco. Estos procedimientos
fueron necesarios para asegurar la eliminación completa de los
lípidos no polares y la obtención de una muestra pura de fosfolípidos
lácteos.
Determinar mediante analicis el comportamiento de los
eluyentes en sus diferentes condiciones.

Imagen tomada de https://fcf.unse.edu.ar/archivos/series-

didacticas/SD-44-Cromatografia-CORZO.pdf
La cromatografía de fluidos supercríticos se considera una técnica de
extracción más eficiente y selectiva que las técnicas convencionales,
como la extracción con disolventes orgánicos. La capacidad de
ajustar la temperatura y la presión del fluido supercrítico permite
ajustar selectivamente la afinidad por los compuestos de interés, lo
que aumenta la selectividad y la eficiencia de la extracción. Además,
los fluidos supercríticos tienen una densidad y viscosidad muy bajas,
lo que les permite penetrar en los poros de los materiales y extraer
los compuestos más eficientemente. También son menos tóxicos y
más amigables con el medio ambiente que los disolventes orgánicos
convencionales. Todo esto hace que la cromatografía de fluidos
supercríticos sea una técnica cada vez más popular en la extracción
de compuestos de interés en diversas industrias, incluyendo la
alimentaria, la farmacéutica y la cosmética.

Referentes Selective extraction of phospholipids from whey protein

de phospholipid concentrate using supercritical carbon
información dioxide and ethanol as a co-solvent” - Sprick, B.,
(norma Linghu, Z., Amamcharla, J. K., Metzger, L. E., & Smith,
APA 7.0) J. S. (2019)

Ejercicio 3: Aplicaciones de la Cromatografía Iónica y de Fluidos

Supercríticos en la Industria de Alimentos.
Tabla 3. Ejercicio 3
Análisis disciplinar La incorporación de diferentes tipos de desechos
mediante ensayo industriales y hogareños, y muy especialmente de
expositivo (mín.350 agroquímicos, son los principales motivos que
palabras – Máx. 500 pueden originar la contaminación de los ambientes
naturales, esencialmente los cursos y cuerpos de
palabras)
agua natural. Los efectos nocivos pueden
minimizarse merced a la foto degradación, proceso
que puede favorecerse por la adsorción de los
contaminantes a arcillas naturales o modificadas
con nano partículas. En este último caso, para el
estudio y seguimiento de la cinética de degradación
de los contaminantes una técnica normalmente
empleada es la cromatografía. En el caso particular
del fenol, es posible aplicar la cromatografía líquida
de alta eficiencia (HPLC, High Performance Liquid
Chromatography). El presente trabajo se enfocó en
la optimización de una técnica para el seguimiento
de la adsorción y degradación de compuestos
orgánicos, en particular fenol, mediante HPLC.
Empleando un equipo Shimadzu CBM-20A, se
obtuvo la mayor eficiencia con una corrida
isotérmica a 25ºC en columna Phenomenex Luna
C18 (2) de 250 mm de longitud y 4,6mm de
diámetro interno usando como fase móvil una
mezcla 50/50 (V/V) acetonitrilo y agua ultra pura
con un flujo de 1mL/min. Se empleó un detector
espectrofotométrico UV (270 nm). La aplicación de
la técnica con estos parámetros permitirá estudiar
convenientemente los mecanismos de la foto
degradación del fenol adsorbido a arcillas
modificadas con nano partículas. Tal como se
 mencionó, obtener una mejor separación y el
tiempo de retención de las sustancias presentes en
la muestra depende principalmente de la
combinación de fase estacionariafase móvil que se
emplee. La fase estacionaria más común consiste
en partículas de silica porosa con largas cadenas
hidrocarbonadas unidas químicamente por enlaces
siloxano (SiO-Si-R). Estas superficies modificadas
con fase enlazada se las conoce como de fase
reversa, entre ellas son muy empleadas la que
presentan un grupo octadecil (C18). Este tipo de
fase aprovecha la reactividad de los grupos
silanoles presentes en la superficie para fijar
moléculas orgánicas mediante enlaces covalentes,
es así que el mecanismo de separación es por
reparto (Rouessac y Rouessac, 2003). Para la fase
móvil de la cromatografía de fluidos supercríticos se
utiliza el dióxido de carbono, cuya temperatura y
presión crítica oscilan entre los 31 °C y las 72,9
atm. Si bien también se pueden emplear otros tipos
de fases móviles como el etanol, el pentano y el
amoniaco, el dióxido de carbono es lo más
recomendable por las siguientes ventajas:
 Como disolvente, es una excelente fase móvil
debido a la gran cantidad de moléculas
orgánicas no polares que contiene.
 Cuenta con un amplio rango de temperaturas
y presiones que se adaptan a los límites de
operación de los equipos de HPLC.
 Es un gas económico y se puede conseguir
fácilmente en el mercado.
 Es transparente en exposiciones
ultravioletas.
 No es inflamable.
 Es un gas no tóxico para su uso.

En este aspecto, la cromatografía de fluidos

supercríticos se asemeja a la de gases debido a
que ambas utilizan los detectores de ionización de
llama. Esto no es posible con la HPLC, por lo que
supone una gran ventaja para trabajar con
compuestos orgánicos muy sensibles. Otros tipos
de detectores que se pueden usar en la SFC son
las luces ultravioletas y el infrarrojo, así como la
emisión de fluorescencia, el termoiónico y el
fotométrico de llama. De esta forma, se podrán
detectar con facilidad los espectrómetros de
masas.
Referentes de Utilización de Cromatografía Líquida de Alta
información (norma Eficiencia (HPLC) para determinar consumo de
APA 7.0) sustrato, Romero Agostina , Escalada Juan Pablo ,
Bregliani Mabela y Pajares Adriana, Facultad de
Ingeniería - UNPSJB, Chubut. Dialnet-
UtilizacionDeCromatografiaLiquidaDeAltaEficienciaH
-5619081.pdf