Practica 1-Cuantificación de Biomasa y Consumo de Sustrato

COMPONENTE PRÁCTICO DEL CURSO BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA
PRACTICA 1: Cuantificación de Biomasa y Consumo de Sustrato
K. Rodríguez, P. Agudelo, A. Jiménez, D. Casallas, M.P. Ballen, P.A. Alfonso Escuela de

Ciencias Básicas e Ingeniería, Universidad Nacional Abierta y a Distancia
Objetivo general
Distinguir como es el crecimiento de unos microorganismos celular mediante medios de
cultivos y reconocer los diferentes sustratos, más distinguidos como azúcares reductores
por el método DNS
Resumen
El desarrollo de la práctica se cumplió con lo establecido por la guía y propuesto por los
integrantes del grupo, el cumplimiento de dicho fue satisfactorio ya que evaluó el
crecimiento del microrganismo celular del microorganismo patógeno ( E.coli) y
determinando de esta el manera el consumo de sustrato aplicando el reactivo DNS donde se
pudo identificar las diferentes fases de crecimiento.
Introducción
En la actualidad para la industria de alimentos sigue siendo vital entender las características
de los microorganismo, hongos y levaduras tanto para la producción de alimentos para el
consumo humano como para conocer la actividad de aquellos que son patógenos y
minimizar sus efectos.
El E. coli crece a altas velocidades a 37°C con una Temperatura, PH y Aw adecuado + la
disponibilidad del sustrato para alimentarse tiene todo para lograr su multiplicación.
Existen etapas de crecimiento:
1)Fase de latencia: Esta es la de adaptación al medio para crecer, degradar sustancias en
nuestro caso la Fructuosa y producir enzimas para poderlas consumir su alimento.
2) Fase exponencial; Es aquel que muestra la multiplicación de las células en su mayor
expresión.
3)Fase Estacionaria: Aquí ya los nutrientes empiezas a escasear.
4)Fase de muerte: Se acaban todos los nutrientes y muere.
Así que bien “Conocer la velocidad de crecimiento de un microrganismo en este caso
patógeno nos permite controlar la inocuidad”.
Para la cinética de crecimiento: Que es ver el crecimiento del microorganismo en el tiempo
existen varios procedimientos:
 Turbimetria
 Recuento en placa
 Cuantificación de peso seco
Con estos análisis podremos predecir la evolución de un medio de cultivo el consumo de
sustrato de este y como se acumulará en el producto deseado en una fermentación.
Luego usaremos el método DIS utilizando glucosa como patrón y como resultado en la
concentración de glucosa mg/ml.
Materiales
 Microorganismo E.Coli
 Caldo nutritivo “Fructuosa” en earlenmeyer de 250 mL
 1 L de reactivo DNS
 Glucosa
 Agua destilada
 Baño de hielo
 Espectrofotómetro y celdas
 Plancha de calentamiento
 Puntas micropipetas estériles
 Balanza analítica
 Centrífuga
 Vórtex
 Pinza
 20 tubos de ensayo
 2 gradillas
 2 pipetas de 10 mL, 5 mL y 1 mL
 Micropipeta de 100-1000 µL
 Pipeteador
 2 Beakers de 600 mL
 2 balones aforados de 100 mL
 3 Beakers de 50 mL
 1 vidrio de reloj
 1 espátula
 Registro fotográfico
PROCEDIMIENTO CURVA DE CALIBRACIÓN BIOMASA
E.Coli caldo nutritivo 24h a 37°C
Extraer 5 mililitros del caldo nutritivo en un tubo de ensayo y tapar- El blanco
Colocar 4 ml de medio + inoculo tiempo 0 refrigerar
Incubar el microrganismo a 37 °C con
3 ml del medio + azucares tiempo 30 min (Refrigerar)
Se deben tomar 2 mL de medio de cultivo y cuantificar la absorbancia con ayuda de un

espectrofotómetro 550 - 600 nm
Realizar el proceso cada 30 min x 5 horas para poder medir las diferentes etapas de
crecimiento.
Utilizar como blanco el medio de cultivo estéril que se almacena en los frascos pequeños
Realizar curva de crecimiento del microorganismo
Graficar absorbancia en el eje Y tiempo en el eje x.

Muestra Absorbancia Tiempo
Muestra blanco 0,1828 9:30
Muestra cero 0,2223 10:00

Muestra 1 0,2124 10:30
Muestra 2 0,2189 11:00
Muestra 3 0,2139 11:30
Muestra 4 0,2110 12:00
Muestra 5 0,2158 12:30
Muestra 6 0,2370 1:00
Muestra 7 0,2171 1:30
Muestra 8 0,3321 2:00
Absorbancia
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12
Podemos afirmar que la absorbancia es directamente proporcional al tiempo ya que a

medida que incrementa el tiempo, también lo hace la absorbancia , el microorganismo en la
hora 5 tuvo su máximo crecimiento.
PROCEDIMIENTO CURVA CONSUMO DE SUSTRATO
Muestra E coli diluir 20 ul en 980 ul agua
A cada tubo adicionar 1 mL de reactivo DNS
Someter los tubos a calentamiento en baño de agua a ebullición 10 min
Enfriar los tubos en agua con hielo durante 5 min
Diluir las muestras en 5 mL de agua
Leer la absorbancia a 540 nm
Cuantificar por interpolación con la curva de calibración.
Realizar curva de consumo de sustrato graficando absorbancia
En el eje Y y tiempo en el eje x.
Muestra Absorbancia
Muestra blanco 0,4366
Muestra cero 0,3890

Muestra 1 0,2735
Muestra 2 0,2723
Muestra 3 0,2600
Muestra 4 0,2241
Muestra 5 0,2153
Muestra 6 0,2083
Muestra 7 0,1971
Muestra 8 0,1840
Curva de consumo de Fructuosa
Absorbancia
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25 f(x) = − 0.00677 x + 0.282456363636364
R² = 0.0394415090675739
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12
De la gráfica podemos afirmar que el sustrato es inversamente al tiempo ya que el tiempo

aumenta, pero el sustrato disminuye
Análisis Consumo del sustrato: Fructuosa
Con los resultados obtenidos del consumo de sustrato de la fructuosa para E.coli nuestro
microorganismo patógeno a analizar pudimos medir su crecimiento en concentración de
consumo de este monosacarido el cual nos muestra que si existe consumo
Después de esto se continua con la determinación, haciendo lecturas de absorbancia en el
espectrofotómetro a 540 nm.
PROCEDIMIENTO CURVA DE CALIBRACIÓN DE AZÚCARES
REDUCTORES
Preparar solución de glucosa 0,2 g/100 mL de agua destilada
Adicionar a cada tubo 1 mL de reactivo DNS
Someter los tubos a calentamiento en baño de agua a ebullición 10 min
Enfriar los tubos en agua con hielo durante 5 min
Diluir las muestras en 5 mL de agua o más de tal forma que la absorbancia

mayor no sea superior a 1
Leer la absorbancia a 540 nm y graficar mg de glucosa/mL
Graficar en el eje X y absorbancia en eje Y
El factor de correlación debe ser superior a 0,97.

Volumen
Concentración Concentración
de glucosa v H20 (ml) Absorbancia
glucosa mg/ml inicial
(ml)
0 1 0 0 0,2086 g
0,1 0,9 0,2086 0,7627 0,002086 g/ml
0,2 0,8 0,4172 2,086 mg/ml
0,3 0,7 0,6258 1,3075
0,4 0,6 0,8344 1,4518
0,5 0,5 1,043 1,7036
0,6 0,4 1,2516 1,909
0,7 0,3 1,4602 2,1252
0,8 0,2 1,6688
0,9 0,1 1,8774 2,4359
1 0 2,086 2,7202
.
Para tener en cuenta: La importancia del método DNS está en la sensibilidad y su fácil
obtención en el mercado, aparte por que se usa una técnica espectrofotométrica, pero que
puede influir en la variación de los resultados:
Las condiciones de Temperatura, ph, Aw, y otros componentes (condiciones de incubación
del medio)
Resultados en general
Se tomaron muestras del medio de cultivo ( E.coli ) y luego se lleva a refrigeración por
media hora , una vez se finaliza el tiempo de incubación posteriormente se realiza una
lectura de absorbancia de cada muestra la cual se observa que no tubo cambio de color lo
cual nos indica que no se obtuvo consumo del sustrato
se realizó con el reactivo DNS que sirve como cuantificantes de azúcares reductores
presentes en la muestra mediante una reacción redox (Miller, 1959), en este caso se realizó
con 10 tubos de ensayo desde el blanco hasta la muestra 8 aplicándoles agua y reactivo
DNS para tomar la absorbancia y ver la acción de los azucares reductores, en este caso se
puede concluir que se obtuvo una buena medición en el espectofometro . la fructosa es un
azúcar reductor ya que es el conocido como el más dulce de todos los monosacáridos
Conclusiones
 Podemos concluir diciendo que el Método DNS se llama reducto por que se oxidan
y se reducen- la glucosa en este caso es el patrón de la muestra
 Existe cambio de coloración de claro a oscuro en la muestra después de su
calentamiento a ebullición lo que cambia el grado de absorbancia.
 Es importante conocer la velocidad de crecimiento de los microorganismos y el
nivel de consumo del sustrato.
1 . de acuerdo a los resultados obtenidos de cinetica de crecimiento por turbidez

describa en el tiempo evaluado si hubo crecimiento , y que velocidad de crecimiento y
que velocidad de crecimiento se logro (unidades de abs /h o pendiente)
Si hubo crecimiento puesto que de acuerdo a la gráfica hay una línea ascendente o la
tendencia lineal es ascendente, con respecto a la velocidad 0,0167 abs/h
2 de acuerdo a los resultados de consumo de sustrato ¿ el sustrato es un azúcar reductor
¿ se evidencia consumo de sustrato
Si el sustrato es un azúcar reductor puesto que se evidencia el consumo de sustrato de

acuerdo a la curva descendente
3 describa una comparación de los resultados obtenidos con los de otro estudio similar
Deacuerdo a otros estudios realizados se puede concluir que la tendencia del sustrato es
disminuir a medida que avanza el tiempo

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PRACTICA 1: Cuantificación de Biomasa y Consumo de Sustrato

K. Rodríguez, P. Agudelo, A. Jiménez, D. Casallas, M.P. Ballen, P.A. Alfonso Escuela de

E.Coli caldo nutritivo 24h a 37°C

Extraer 5 mililitros del caldo nutritivo en un tubo de ensayo y tapar- El blanco

Colocar 4 ml de medio + inoculo tiempo 0 refrigerar

Incubar el microrganismo a 37 °C con

3 ml del medio + azucares tiempo 30 min (Refrigerar)

Se deben tomar 2 mL de medio de cultivo y cuantificar la absorbancia con ayuda de un

Realizar curva de crecimiento del microorganismo

Graficar absorbancia en el eje Y tiempo en el eje x.

Muestra cero 0,2223 10:00

Podemos afirmar que la absorbancia es directamente proporcional al tiempo ya que a

Muestra E coli diluir 20 ul en 980 ul agua

A cada tubo adicionar 1 mL de reactivo DNS

Someter los tubos a calentamiento en baño de agua a ebullición 10 min

Enfriar los tubos en agua con hielo durante 5 min

Diluir las muestras en 5 mL de agua

Leer la absorbancia a 540 nm

Cuantificar por interpolación con la curva de calibración.

Realizar curva de consumo de sustrato graficando absorbancia

En el eje Y y tiempo en el eje x.

Muestra cero 0,3890

De la gráfica podemos afirmar que el sustrato es inversamente al tiempo ya que el tiempo

Preparar solución de glucosa 0,2 g/100 mL de agua destilada

Adicionar a cada tubo 1 mL de reactivo DNS

Someter los tubos a calentamiento en baño de agua a ebullición 10 min

Enfriar los tubos en agua con hielo durante 5 min

Diluir las muestras en 5 mL de agua o más de tal forma que la absorbancia

Leer la absorbancia a 540 nm y graficar mg de glucosa/mL

Graficar en el eje X y absorbancia en eje Y

El factor de correlación debe ser superior a 0,97.

1 . de acuerdo a los resultados obtenidos de cinetica de crecimiento por turbidez

Si el sustrato es un azúcar reductor puesto que se evidencia el consumo de sustrato de

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